Modalitatea de acțiune este inhibarea sintezei proteinelor prin legarea la subunitatea ribozomală 30S a microorganismelor sensibile la
oxitetraciclină, prin urmare
împiedicând conexiunea dintre ribozomi și aminoacil-ARNt. De asemenea, se crede că oxitetraciclina se conectează invers cu ribozomii 50S și modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice a microorganismelor sensibile. Oxitetraciclina, în concentrații mari, poate inhiba, de asemenea, sinteza proteinelor în celule.